2022 年新版国家标准明确 SPF （无特定病原体）级大、小鼠需排除多种必检病原体，还需对特定病原体进行必要时检测。但当前的检测技术存在分离培养技术耗时长、操作复杂且依赖人员经验判断结果、检测成本高、易现假阳性等局限，构建标准化的实验动物病原微生物分子检测平台已成为行业发展的迫切需求。
实验动物教研部在中心及学校仪器设备开放共享项目基金支持下，历时二年搭建起了实验动物病原微生物分子检测共享支撑平台。该平台配备PCR 仪、实时定量 PCR 仪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统等，以满足分子检测全流程基础操作需求。
图1 微生物分子检测实验室相关仪器设备
由吴杰敏博士、任静博士、马西祥博士、周顺长副教授组成的团队依据2022 年新版国标通过 NCBI GenBank 数据库检索获取细菌 16S rDNA 序列、病毒核酸种类及保守区域序列，并运用 NCBI Primer 插件设计特异引物；同时，结合相关文献进一步确认各病原微生物的检测部位、生物学性质等关键技术参数，同步开展阳性对照体系构建工作，以确保后续检测结果的可靠性：目前团队已完成 17 种必检病原微生物检测序列质粒的合成，另补充基因组标准品（图2），涵盖 7 种细菌与 2 种病毒。
图2 部分病原微生物DNA标准品证书
团队以其中一种病原菌为研究对象，对引物的特异性及实时荧光定量 PCR 检测的灵敏度进行验证。序列比对与 PCR - 凝胶电泳结果均证实，设计引物具有良好的特异性（图 3 A和B）；标准曲线分析结果显示，此检测方法的灵敏度可达 5 拷贝 / 微升（图 3 C和D）。
图3 引物的特异性及qPCR 检测灵敏度
同时，团队确定了提高病原微生物分子检测质量的环节即取材应精准选取检测样本（肝、肺及肠道内容物）、核酸提取应加强分离纯化 DNA 与 RNA、应注意 RNA 转化为 cDNA的过程控制以及稀释模板与上机定量检测的精准。
图4 病原微生物分子检测流程
目前，该检测平台涵盖中心自检与对外服务两大维度。中心自检包括进转化楼15楼前的检疫期抽检、不同供应商季度检测、各楼层哨兵鼠定期检测及患病小鼠检测，以保障内部动物质量与健康；对外服务则围绕外部需求提供支持，重点为抽检，同时承接外单位检测需求及其他指定微生物检测。
通过该平台实现了重要病原体高效、精准、同步检测，有效提升我校实验动物质量，保障科研数据可靠，为生命科学研究及生物医药产业高质量发展筑牢基础，推动相关科研工作规范化、高效化。
（文：任静、马西祥；审核：周顺长）
